Оборудование

• Сканирующий ион-проводящий микроскоп с конфокальной приставкой;
• Система для электрохимических измерений на единичных клетках;
• Совмещенная система АСМ и СИПМ;
• Система скрининга лекарственных средств на единичных клетках;
• Лазерный пуллер;
• Лабораторная мебель.

• Система очистки воды;
• Установка для пиролитического осаждения углерода внутри нанокапилляров;
• Ламинар для работы с первичными клетками;
• Ламинар для работы с клеточными линиями;
• Инкубатор для работы с первичными клетками;
• Инкубатор для работы с клеточными линиями;
• Оптический микроскоп;
• Вытяжной шкаф;
• Рабочий стол-верстак;
• Автоматическое дозирующее устройство Swiftpet PRO;
• Центрифуга лабораторная;
• Микроцентрифуга;
• Вортекс;
• Термостат;
• Аналитические весы;
• рН-метр;
• Ультразвуковая мойка (баня);
• Автоклав.

Сканирующий ион-проводящий микроскоп с конфокальным модулем (СИПМ) представляет собой биологический исследовательский инструмент, который объединяет в себе методы сканирующей ион-проводящей микроскопии, конфокальной микроскопии, сканирующей электрохимической микроскопии.

С помощью данной установки возможно одновременно при сканировании получить: (1) изображение топографии живых объектов (например, клеток) с нанометровым разрешением, (2) картирование по механическим свойствам, (3) конфокальное изображение биологического образца совмещенное с топографией клетки, (4) распределение метаболитов (например, активных форм кислорода) на поверхности клеток, (5) оптическое изображение клетки совмещенное с топографией и флуоресцентным изображением.

Одним из важных преимуществ УНУ является возможность получения топографии образцов в прыжковом режиме. Данный режим, во-первых, позволяет получать изображения с образцов со сложной структурой (например, клетки с микровилиями и отростками), во-вторых, позволяет увеличить скорость сканирования за счет адаптивного разрешения и высоты прыжка зонда для различных частей области сканирования.

Суть адаптивного сканирования заключается в предварительном сканировании с низким разрешением для оценки шероховатости различных частей области сканирования. В областях образца с высокой шероховатостью используется высокое расположение зонда и высокое разрешение в пикселях, а на плоских участках — низкая высота и разрешение, что позволяет увеличить скорость сканирования в более чем 5 раз. Еще одной отличительной чертой данной установки является измерение механических свойств клетки под воздействием эффектора в динамике на протяжении длительного времени, например, в течение часа с сохранением нативных свойств клетки. АСМ в этом плане обладают значительными недостатками, поскольку не позволяет измерять механические свойства в динамическом режиме из-за сильного влияния на биологический образец. В УНУ впервые реализована возможность углового подвода и сканирования под углом, что обеспечивает изучение краев клеток, контактирующих с подложкой. Практически во всех СИПМ пьезоэлектрический привод устанавливается непосредственно над объективом инвертированного микроскопа.

Эта конструкция особенно полезна, если в качестве наконечника пипетки используется оптический метод, такой как конфокальная микроскопия, а фокус объектива микроскопа может быть совмещен. Угол подхода от 0 ° до 90 ° относительно нормали к поверхности и пипетка со скошенной кромкой используются для компенсации внеосевого размещения пипетки. Кроме того, в этой установке вместо инвертированного оптического микроскопа может использоваться вертикальный оптический микроскоп, позволяющий получать оптические изображения образцов, выращенных на непрозрачных подложках. Существенным преимуществом перед аналогичной установкой компании Park Systems является совмещенное одновременное получение конфокального и топографического изображения за счет одновременного перемещения зонда СИПМ и луча лазера, что позволяет проводить коррелятивные клеточные измерения в режиме реального времени.

Данная технология позволяет решить проблему изучения быстро протекающих биологических процессов в клетке. В настоящее время в России и в мире не существует аналогов, которые позволяли бы проведение столько обширных и масштабных исследований в области биофизики. Использование данной установки не ограничивается получением топографии живых объектов. УНУ может использоваться для контролируемой наноинжекции различных веществ внутрь или вблизи биологических объектов, что может быть использовано для доставки разрабатываемых лекарственных средств к биологическим объектам. Разработанная система обеспечивает контролируемую доставку нескольких веществ и одновременное обнаружение реакции биологического образца.

Точное позиционирование зондов на основе нанопипеток для нацеливания на определенные области клеток, а также возможность сочетать это с методами оптической флуоресценции позволяет беспрецедентно контролировать нанесение веществ (например, агонистов или антагонистов) и определять распределение нанообъектов (наночастиц, белков, наногелей) на поверхности или внутри живых клеток. Важным преимуществом перед имеющимися аналогами является получение одновременной топографической и электрохимической картины с использованием многоканальных зондов.

УНУ позволяет одновременно получать и обрабатывать информацию от двух каналов нанозонда. Это дает возможность изучать поверхность электрохимически активных материалов, например катодов литий-ионных аккумуляторов. Существующие аналоги позволяют получать лишь электрохимическое картирование образцов, что является их недостатком, поскольку топография образца также представляет важную ценность при изучении материалов. Заявляемое устройство для изучения живых клеток, их структуры и состава на наномасштабе дает ценную информацию о сложных процессах, происходящих в биологических системах.

В состав УНУ включен блок сканирования образцов, конфокальный модуль, оптический микроскоп, контроллер. Дальнейшее усовершенствование установки возможно в сторону увеличения скорости сканирования, разработка нового режима растрового сканирования, увеличение области сканирования вплоть до 100*100 мкм, увеличение количества лазеров и новых флуоресцентных фильтров. Это позволит существенно расширить спектр проводимых с её помощью исследований. Период сохранения уникальности составляет порядка 7-10 лет.

1. Была продемонстрирована возможность проведения качественного и количественного анализа клеточных наномеханических свойств различных живых клеток. Была продемонстрирована возможность получения топографии и определения наномеханических свойств, что позволило проведение долгосрочных исследований механических свойств, а также определение наномеханических свойств при изменении актиновых филаментов и микротубулина, вызванных лекарственными средствами. (Kolmogorov V. S. et al. Mapping mechanical properties of living cells at nanoscale using intrinsic nanopipette—sample force interactions //Nanoscale. — 2021. — Т. 13. — №. 13. — С. 6558-6568.)
2. Разработана методика исследования функциональных свойств поверхности живых биологических объектов с наноразмерным разрешением, такие как картирование pH. С помощью платформы удалось осуществить точное позиционирование нанозонда на поверхности клетки с помощью обратной связи СИПМ для мониторинга локального pHe с высоким пространственно-временным разрешением и высокой чувствительностью. Кроме того, было показано, что двуствольные нанозонды SICM-pH могут быть изготовлены и использованы для объединения преимуществ сканирования с высоким разрешением с обратной связью SICM и высокочувствительного измерения pH, что позволяет одновременно получать 3D-карту топографии и pH одиночных живых клеток в реальном времени.(Zhang Y. et al. High-resolution label-free 3D mapping of extracellular pH of single living cells //Nature communications. — 2019. — Т. 10. — №. 1. — С. 1-9.)
3. Было обнаружено, что воздействие AngII вызывает смягчающий эффект (снижение модуля Юнга) в изолированных кардиомиоцитах взрослых крыс, который зависит от рецептора ангиотензина типа 1 (AT1) и косвенно опосредовано трансформацией фактора роста-β1 (TGF-β1) и киназы Rho. Кроме того, исследование микротрубочек после обработки AngII выявило значительное уменьшение популяций ацетилированных и детирозинированных МТ; это свидетельствует о том, что посттрансляционные модификации (PTM), которые стабилизируют MTs, больше всего подвержены влиянию AngII (Pamela Swiatlowska, Jose L. Sanchez-Alonso, Catherine Mansfield, Denis Scaini,bc Yuri Korchev, Pavel Novak and Julia Gorelik «Short-term angiotensin II treatment regulates cardiac nanomechanics via microtubule modifications» // Nanoscale (2020), 12, 16315-16329
4. Было показано, что сборка и высвобождение вирусоподобных частиц с верхней, беспрепятственной поверхности клеток может быть в 20 раз быстрее, чем сообщалось для отростка из плазматической мембраны в контакте со стеклянной подложкой. Кроме того, топологические изменения, связанные с почкованием вирусоподобных частиц, значительно различаются в зависимости от используемой клеточной модели и вирусного белка, который помечен.
5. Было визуализирована неоднородная активность HER на треугольном однослойном нанолисте 1H-MoS2, 2-гетероструктурах нанолиста MoS2 и WS2 с помощью данной установки. Была представлена информация о локальных каталитических свойствах, а также электрохимические изображения тока HER, наклона Тафеля и перенапряжения путем измерения циклических вольтамперограмм во всех точках измерения во время построения изображения.

• Проведен аналитический обзор современной литературы, затрагивающий конструирование in vitro моделей болезни Альцгеймера и включающий более ста источников. На основе обзора литературы выбраны оптимальные параметры и протестированы in vitro модели болезни Альцгеймера, основанные на обработке нейрональных клеток синтетическим бета-амилоидным пептидом и его модифицированными формами. Представлены оптимальные варианты in vitro моделей с использованием клеток нейробластомы человека SH-SY5Y и клеток нейробластомы мыши Neuro2a.
• Показано, что в данных моделях воспроизводится ряд основных патогенных эффектов бета-амилоида, включая нарушение актинового цитоскелета, индукцию окислительного стресса, нарушение функции митохондрий и нейротоксичность.
• В соответствии с лабораторным регламентом была получена серия экспериментальных образцов органических соединений, влияющих на формирование бета-амилоидных структур. Контроль качества полученных образцов осуществлялся в соответствии разработанными программа и методиками испытания.
• Разработаны методики оценки агрегации/дезагрегации амилоида и моделирования формирования амилоидных бляшек на клеточных культурах. Показано, что разработанные эффективные соединения оказывают дезагрегирующее действие на амилоидные фибриллы на клеточных культурах in vitro. Разработаны методики оценки цитотоксичности и эффективности инновационных эффективных препаратов, влияющих на белковые агрегаты на моделях in vitro с использованием флуоресцентных и электрохимических методов.
• С использованием УНУ «Сканирующий ион-проводящий микроскоп с конфокальным модулем» впервые продемонстрировано формирование белковых агрегатов бета-амилоидов на поверхности разработанных клеточных моделей. Локальное сканирование топографии позволило определить формирование пороподобных структур и разрушение мембраны клетки в области их формирования. Установлено, что формирование белковых агрегатов н поверхности мембраны клеток приводит к значительному повышению среднего модуля Юнга клетки, опосредованного стабилизацией цитоскелета, в то же время в области формирования агрегатов характеризуется локальным снижением механической жесткости, ввиду локального нарушения структуры цитоскелета. Влияние амилоидных фибрилл на метаболизм клеточных метаболитов было подтверждено с использованием электрохимических и флуоресцентных методов исследования.
• В ходе работы проведена оценка эффективности разработанных инновационных препаратов. Оценка эффективности выполнена измерения механических свойств клеток в условиях последовательной инкубации клеток с бета-амилоидом и инновационными препаратами. Некоторые разработанные препараты продемонстрировали успешное снижение механического напряжения в клетках нейробластомы. Кроме того, коррелятивная сканирующая ион-проводящая микроскопия в комбинации с конфокальной микроскопий позволила подтвердить успешное связывание разработанных молекул и агрегата бета-амилоида.
• В рамках проекта был разработан метод, позволяющий определять белковые агрегаты на уровне единичных молекул. С помощью данного метода были изучены транслокационные свойства бета-амилоидных агрегатов, а также было проведена характеризация данных агрегатов с помощью атомно-силовой микроскопии. Для анализа полученных данных было разработано программное обеспечение, которое позволяет анализировать полученные данные и делать вывод о наличии/отсутствии в пробе бета-амилоидных агрегатов.
• Впервые исследован эффект хронического пренатального воздействия ультразвука переменной частоты на поведенческий фенотип взрослых крыс, а также на изменение концентрации ряда биохимических маркеров в тканях головного мозга и плазме крови крыс.
• Начат эксперимент по изучению длительного влияние хронического ультразвукового стресса на организм животного в течение всей жизни. Был выполнен первый этап, на котором изучили влияние хронического УЗ стресса на когнитивные и моторные функции молодых крыс. В дальнейшем планируется длительное наблюдение за животными в течение всей жизни.
• Разработаны протоколы получения монокультуры астроцитов и ко-культуры астроциты — глиомы. Проведено сравнение монокультуры астроцитов и клеток глиомы С6 с целью получения количественной оценки степени злокачественности клеток.
• В рамках этапа проекта разработана эскизная конструкторская документация на модуль для проведения биологических экспериментов с контролируемыми внешними условиями для УНУ. Данный модуль позволит поддерживать температуру при проведении клеточных экспериментов.

1. Изучение топографии биологических объектов с помощью сканирующей ион-проводящей микроскопии.
2. Изучение механических свойств единичных клеток (наномеханика).
3. Изучение активности ионных каналов единичных клеток.
4. Коррелятивное измерение топографии, механических свойств и конфокальной визуализации методом сканирующей ион-проводящей микроскопии.
5. Проведение локальных электрохимических измерений с дополнительным картированием образца.
6. Изучение динамики биомолекул и их взаимодействия в живых клетках.
7. Изучение воздействия противораковых препаратов на опухолевые клетки.
8. Развитие исследования в области электрохимических процессов в материаловедении.

Инвертированный исследовательский микроскоп Nikon Eclipse Ti2

Назначение, краткая характеристика: Nikon Eclipse Ti2 — оптический инвертированный микроскоп, позволяющий получать оптические изображения биологических образцов, а также проводить позиционирование нанокапилляра на выбранный объект с последующим его сканированием. Микроскоп оснащен объективами 10x, 40x, 100x, а также оснащен камерой, позволяющей в режиме реального времени передавать информацию от микроскопа на ПК, и получать изображения с высоким разрешением. Микроскоп обладает управляемой системой освещения для флуоресцентной микроскопии CoolLed pE-300, который обеспечивает широкий спектр освещения, охватывающий полосы возбуждения обычных флуорофоров, таких как DAPI, CFP, Aqua, FITC, TRITC, TxRed, Cy5 и многих других.

Конфокальный модуль для системы исследования биологических микрообъектов

Назначение, краткая характеристика: Конфокальный модуль имеет 2 лазера (473 и 655 нм) позволяет получать конфокальные изображения при одновременном сканировании поверхности образца. Включает в себя двухканальный фотометр с рабочими длинами волн счетчиков фотонов (для GFP) 185-870 нм; (для Cy5) 230-920 нм.

Система исследования биологических микрообъектов методами измерения ионной проводимости

Назначение, краткая характеристика: Система предназначена для определения топографии с нанометровым пространственным разрешением и проведения измерений ионной проводимости каналов биологических микрообъектов, таких как клетки, бактерии, ткани.

Измерительная система включает в себя: X-Y-позиционер; Z-позиционер; механическое основание; блок управления.

Z — позиционер, характеристики: быстрое перемещение по вертикали (ось Z): 25мм, скорость до 1,5 мм/сек, минимальный шаг 0,05 мкм.

Ручное позиционирование зонда в плоскости XY: 13×13 мм, разрешение 1 мкм.

Cистема нанопозиционирования: наличие встроенного емкостного датчика перемещения, диапазон 25×25мкм, точность позиционирования 0,1нм, наличие автоматизированного подвода зонда.

X-Y —позиционер, характеристики: наличие емкостного встроенных датчик перемещения; диапазон сканирования при напряжении от минус 20 до 120 В ,60×60мкм; диапазон сканирования в режиме обратной связи 45×45мкм; точность позиционирования 0,3 нм; линейность в режиме обратной связи 0.03%.

Универсальный контроллер для сканирующей зондовой микроскопии

Назначение, краткая характеристика: Контролер обеспечивает полноценную работу всех устройств УНУ, обрабатывает и передает данные на ПК. Количество аналоговых выходов — 8 шт, количество аналоговых входов — 8 шт. Разрешение АЦП — 16 бит. Частота дискретизации — 750 кГц. Диапазон напряжений от −10 до 10 В.

Высоковольтный усилитель с системой считывания сигналов сенсоров перемещения пьезоманипуляторов

Назначение, краткая характеристика: Пьезосистема отвечает за позиционирование и сканирование нанокапилляром поверхности образца. Диапазон входных напряжений от 0 до 5 В, диапазон выходных напряжений от 0 до 100 В.

Антивибрационный стол

Назначение, краткая характеристика: Оптический стол Nexus представляет собой оптическую плиту (750×1200×110 мм) с отверстиями M6, опоры с системой пассивной виброизоляции (высота: 800 мм) и обеспечивает неподвижность и защиту всей системы от вибраций при проведении исследований.

Методика получения топографии живых клеток

Методика измерения механических свойств материалов с низким модулем Юнга

Методика одновременного получения топографии и картирования по механическим свойствам

Методика картирования поверхности электрохимически активного материала

Методика обнаружения биологических аналитов внутри живых организмов

Методика получения конфокальных изображений биологических образцов

Методика локальной фиксации потенциала (patch-clamp)

• Получение топографического изображения живой клетки.
• Получение распределения модуля Юнга живой клетки.
• Одновременное получение топографического изображения и определение механических свойств клетки (картирование по модулю Юнга).
• Коррелятивные исследования топографии, механических свойств с одновременным получением конфокального изображения клетки.
• Анализ топографии поверхности образца.
• Измерение механических свойств мягких материалов.
• Проведение измерений активности ионных каналов клеток.
• Конфокальная сканирующая микроскопия.
• Конфокальная сканирующая микроскопия с одновременным использованием сканирующей ион-проводящей микроскопии.
• Определение биологических аналитов внутри биологических моделей (клетки, сфероиды, живые организмы).
• Исследование и анализ выживаемости живых клеток.

Единицей измерения выполняемых работ считается один час приборного времени. Стоимость одного часа времени на УНУ составляет 10 000 руб.

Расчет общей стоимости работ проводится на основе общего времени, предоставленного для выполнения указанных в заявке экспериментальных работ, по результатам рассмотрения и одобрения заявки.

• Регламент доступа к оборудованию ОИ, предусматривающий порядок выполнения работ и оказания услуг для проведения научных исследований, а также осуществления экспериментальных разработок в интересах третьих лиц; условия допуска к работе на оборудовании ОИ.
• План работы ОИ, содержащий информацию о текущей и планируемой загрузке оборудования.
• Локальный акт владельца ОИ о создании ОИ
• Проект гражданско-правового договора о выполнении работ и (или) оказании услуг для проведения научных исследований, а также осуществления экспериментальных разработок.